Estandarización de una PCR anidada para la identificación de Lawsonia intracellularis en porcinos

Introduction: the nested Polymerase Chain Reaction (pcr)technique has been standardized for the diagnosis of porcine proliferative enteropathy caused by Lawsonia intracellularis. Methods: such technique was based upon amplifying a region of 270 pb of the 16s arnr gene of the Lawsonia intracellularis. For such purposes, adna sample was taken from the bacteria with a Purelink Genomic kit, Invitrogen ®, from 100 samples of porcine ileum of the metropolitan area of Bucaramanga (Santander). The dna samples were quantified with fluorometry and adjusted to 20 ng/μL concentration. The first amplification of the 319 pb part of the 16s gene was completed with the external initiators: 5’-tat ggc tgt caa aca ctc cg-3’ and 5’-tga agg tat tgg tat tct cc-3’. The result of this first amplification was used as a pattern for the second reaction, where the internal part of 270 pb of the 16s arn gene of L. intracellularis was amplified using the specific internal initiators: 5’- tta cag gtg aag tta ttg gg-3’ and 5’-ctt tct cat gtc cca taa gc-3’. The optimal conditions for the pcr for both internal and external initiators included 2,5 μm de mgcl2; 0,15 μm of each dntp; 1x of reaction buffer; 0,8 μm of each initiator; and 2,5u of Taq polymerase. As a positive control for the taken dna samples and the pcr, the bacterial dna taken from Enterisol ®(Boheringer Ingelheim®) was used. Results: optimal temperatures of annealing for the simple and nested pcr were 50 and 55°C, respectively. The detection limit of the technique was 5 fg. Conclusions: no cross reactions were found with Esquerichia coli, or with Salmonella typhimurium, which are bacteria with similar clinical conditions.Se estandarizó una técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR anidada para el diagnóstico de la enteropatía proliferativa porcina causada por la bacteria Lawsonia intracellularis. La técnica se basó en la amplificación de una región de 270 pb del gen 16s arnr de Lawsonia intracellularis; para tal fin, se extrajo el adn de la bacteria mediante el kit Purelink Genomic, Invitrogen®, a partir de 100 muestras de íleon de porcinos provenientes del área metropolitana de Bucaramanga (Santander). Los adn fueron cuantificados por fluorometría y ajustados a una concentración de 20 ng/µL. Se llevó a cabo una primera amplificación de la porción de 319 pb del gen 16s arn con los iniciadores externos: 5’-tat ggc tgt caa aca ctc cg-3’ y 5’-tga agg tat tgg tat tct cc-3’. El producto de esta primera amplificación se usó de molde para una segunda reacción, en la que se amplificó una porción interna de 270 pb del gen 16s arn de L. intracellularis, empleando los iniciadores internos específicos: 5’-tta cag gtg aag tta ttg gg-3’ y 5’-ctt tct cat gtc cca taa gc-3’. Las condiciones óptimas para las pcr tanto con los iniciadores internos como con los externos incluyeron: 2,5 mm de mgcl2; 0,15 mm de cada dntp; 1x de Buffer de reacción; 0,8 µm de cada iniciador; y 2,5 U de Taq polimerasa. Como control positivo tanto en la extracción de adn como en las pcr, se empleó ADN bacteriano extraído de la vacuna Enterisol® (Boheringer Ingelheim®). Las temperaturas óptimas de anillamiento para la pcr simple y anidada fueron de 50 y 55°C, respectivamente. El límite de detección de la técnica fue de 5 fg. La técnica no evidenció reacción cruzada con Esquerichia coli, ni con Salmonella typhimurium, bacterias con cuadros clínicos semejantes

Estandarización y validación de la prueba de pcr anidada para el diagnóstico de especies del género xyleborus (coleoptera: curculionidae: scolytinae)

. In this study it was standardized and validated the nested PCR test for rapid, sensitive and reliable detection of species of the genus Xyleborus using external primers CI-J-2183 and TL2-N-3014 and internal primers J2210 and N2739 that amplify a band of 500 bp in the region of the gene mitochondrial Cytochrome Oxidase subunit 1(CO1). Also, DNA extraction from 26 specimens of Xyleborus was realized with kit Qiagen DNeasy ® mericom Food (DMF), not previously reported its use for their application in insects, which resulted in enough DNA and high-quality for amplification by PCR reactions. The method allowed to process a single insect by extraction, and obtain genetic material from specimens preserved in alcohol of up to eight years old. The detection limit was defined up to a concentration of 780 pg/uL. The PCR was optimized in a final volume of 15 µL without compromising quality of amplification. The standardized test allowed quality DNA, which ensured high reproducibility and sensitivity in the detection of species of Xyleborus and partial sequencing of the CO1 gene to the seven species studied; consensus sequences were analyzed by homology and deposited in the GenBankEn este estudio se estandarizó y validó la técnica de PCR anidada para la detección rápida, sensible y confiable de especies del género Xyleborus mediante el uso de los primers externos CI-J-2183 y TL2-N-3014 e internos J2210 y N2739, que amplifican una banda de 500 pb de la región del gen mitocondrial Citocromo Oxidasa subunidad 1(CO1). Asimismo, se realizó la extracción de ADN de 26 ejemplares de Xyleborus con el kit Qiagen DNeasy® mericom Food (DMF), no reportado previamente su uso para su aplicación en insectos, que resultó en ADN suficiente y de alta calidad para reacciones de amplificación por PCR. El método permitió procesar un solo insecto por extracción, y obtener material genético de muestras conservadas en alcohol de hasta ocho años de antigüedad. El límite de detección se definió hasta una concentración de 780 pg/ul. Se optimizóla PCR en un volumen final de 15 uL sin comprometer calidad de la amplificación. La técnica estandarizada permitió la obtención de ADN de calidad, lo que aseguró alta reproducibilidad y sensibilidad en la detección de especies de Xyleborus y la secuenciación parcial del gen CO1 para las siete especies estudiadas; las secuencias consenso fueron analizadas por homología y depositadas en el GenBank

Diagnóstico de <i>Mycoplasma suis</i> con técnicas convencionales y de biología molecular : Su relación con circovirus porcino tipo 2

La hemoplasmosis porcina (HP), es una enfermedad de distribución mundial producida por Mycoplasma suis, que provoca anemia hemolítica en los cerdos. El objetivo del trabajo fue realizar el diagnóstico de M. suis, a través de estudios hematológicos y de técnicas de biología molecular así como determinar su relación con circovirus porcino tipo 2 (PCV-2). El estudio incluyó 482 cerdos de distintas categorías provenientes de 30 establecimientos. Además se realizaron estudios anatomopatológicos e inmunohistoquímicos (IHQ) en 44 animales positivos a M. suis, que murieron en el período de estudio. Los mismos presentaban signología asociada a PCV-2. Se obtuvieron datos productivos, sanitarios y de manejo de cada uno de los establecimientos. Por último se realizó un análisis exploratorio de los datos recolectados mediante software de dominio público EpiInfoTM, Epidat versión 4.0. Mediante los resultados del estudio hematológico se pudo observar anemia en el 59,7% de animales, siendo el 34% positivos a M. suis. Las categorías más afectadas fueron lechones y recría. En los frotis teñidos con May Grünwald-Giemsa se observó un mayor porcentaje de animales positivos a M suis con respecto a la coloración de Naranja de Acridina. La técnica de PCR diseñada para detectar M. suis permitió identificar un 36% de animales positivos. Mediante la técnica de PCR para PCV-2, se pudo identificar un 31,7% de animales positivos en el total de la población. Se observó que el 8,7% de los animales infectados naturalmente con M. suis eran también PCV-2 positivos. Mediante la técnica de IHQ se pudo demostrar inmunomarcación positiva para PCV-2 en el 70,5% de los casos sospechosos PCV-2-AD en las muestras provenientes de animales no vacunados y positivos a M. suis. Se concluye que los estudios hematológicos brindan información sobre la presencia de la bacteria como también de las alteraciones en la morfología celular sanguínea. Hasta donde sabemos, y según la bibliografía consultada, este sería el primer diseño y puesta a punto de una técnica de PCR específica para M. suis realizada en nuestro país. Estas técnicas son una herramienta de diagnóstico relativamente rápidas y junto con la signología clínica permiten tomar medidas preventivas y/o de tratamiento en las granjas porcinas.Facultad de Ciencias Veterinaria